PRACTICA NO. 6

CUENTA DE PLAQUETAS CON CÁMARA DE NEUBAUER

 OBJETIVO

Realizar e interpretar la técnica para la cuenta de trombocitos o plaquetas en la cámara de Neubauer.

FUNDAMENTO

Los trombocitos o plaquetas constituyen una parte esencial del organismo hemostático del cuerpo. Son cuerpecillos hialinos incoloros que miden de 2-4 μ, de bordes irregulares, pero pueden tener forma esférica u ovalada, carecen de núcleo y son muy frágiles. Provienen de una célula gigante que mide de entre 50-100 μ de diámetro llamada megacariocito.

Una de las principales funciones de las plaquetas es participar en los mecanismos de la hemostasia (Hemos=sangre, stasis=detención) adhiriéndose entre ellas y a las paredes de los vasos sanguíneos lesionados, para formar así el trombo plaquetario o tapón hemostático.

El líquido diluyente puede ser una solución estéril de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo (85 milimolar) y cloruro de sodio (31 milimolar). Este líquido se provee listo para usar y su conservación es indefinida en refrigerador (2 - 10° C) o puede ser también oxalato de amonio al 1%. El fundamento del método consiste en la producción de hemólisis por la utilización de un líquido hipotónico, y el mantenimiento de las plaquetas intactas y sin agrumar por la presencia de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo.

MATERIAL

Pipeta de Thoma para glóbulos rojos (perla roja)
Equipo para venopuncion (Tubo lila)
Boquilla roja
Tubo de goma
Tubos de ensayo
Papel parafilm
Cámara de Neubauer
Cubrehematimetro
Microscopio
Gasas
Caja de Petri
Papel filtro

SUSTANCIAS

Alcohol al 70%
Sangre venosa
Diluyente de plaquetas

PROCEDIMIENTO

1. Obtener 10 ml de sangre venosa, en un tubo con anticoagulante EDTA

2. Agitar la sangre de manera suave en el tubo para mezclarla con el anticoagulante

3. Llevar la sangre hasta la marca 1.0 de la pipeta de Thoma. Limpiar la punta con una gasa

 

4. Aforar con liquido diluyente de plaquetas hasta la marca 101 de la pipeta (Dilución 1:100)

5. Tapar los extremos con papel parafilm y mezclar durante 1 minuto

6. Colocar la Cámara de Neubauer sobre una superficie horizontal y poner el cubrehematímetro sobre las mesetas

7. Descartar las primeras 4 gotas de la pipeta. Con la quinta gota cargar la cámara, depositándola entre la meseta y el cubrehematímetro y dejarla difundir por capilaridad, teniendo cuidado de que no se formen burbujas o se derrame el líquido hacia los surcos

 

8. Colocar la cámara de Neubauer ya cargada en el interior de una caja de Petri, con papel filtro humedecido en agua para evitar la evaporación, dejar en reposo de 10 a 15 minutos

 

9. Observar al microscopio contando en la cuadricula central (para glóbulos rojos) las plaquetas que aparecen mucho más pequeñas que los hematíes, redondas, alargadas u ovales, altamente refringentes

10. El cuadro central de la cuadricula mide 1.0 mm por lado y está dividido en 16 cuadritos más pequeños, de tal manera que el número total de estos últimos es de 400, mismos en los que se lleva a cabo el recuento de plaquetas.

OBSERVACIONES

Cámara de Neubauer, 10x

Enfocando la cuadricula central se aprecian los 25 cuadros centrales, con una gran cantidad de plaquetas en ellos. Se pueden distinguir solo algunos eritrocitos, mucho mayores que las plaquetas, que desprenden gran brillo

Cámara de Neubauer, 40x

Uno de los cuadros centrales, lleno de plaquetas, de forma redonda la mayoría u ovalada.

RESULTADOS

Los recuentos de plaquetas, al igual que los eritrocitos y leucocitos, se expresan como concentraciones, que en este caso serían número de células por unidad de volumen de sangre, que es 1mm3

Después de contar las plaquetas presentes en los 400 cuadritos centrales, el número obtenido se multiplica por el factor de dilución de la siguiente manera:

N° de plaquetas x mm3 = No. De plaquetas contadas X dilución X 10

Dilución: 1:100

Este factor corresponde, para obtener los resultados por mm3 ya que el volumen de la cámara es de 0.1 mm3

El número de plaquetas fue de 535, por lo que al realizar los cálculos quedaron así:

No. de plaquetas = 535 X 100 X 10= 535 000 plaquetas por mm3, lo que indica un índice elevado de plaquetas.

VALORES DE REFERENCIA

(Millones de células/mm3)

Hombres y Mujeres:………………………………..150 000 - 450 000

CONCLUSIÓN

El recuento de plaquetas es de suma importancia y es parte del recuento celular de la sangre como prueba de rutina.

El paciente con un trastorno hemorrágico, clínicamente significativo, acude al médico con algunos tipos de síntomas hemorrágicos, con lo que se puede indicar la parte defectuosa del mecanismo de coagulación, y dentro de estas causas pueden estar la cantidad inadecuada de plaquetas.
La hemorragia de vasos sanguíneos subcutáneos en piel intacta se puede ver como petequias o equimosis. Cuando se encuentran equimosis en gran cantidad y sin traumatismo aparente, el trastorno se conoce como Diátesis Hemorrágica y puede ser producida por anormalidades en los vasos sanguíneos, por la disminución en el número de plaquetas o por el mal funcionamiento.
La disminución de plaquetas se denomina Trombopenia o púrpura trombocitopénica y se debe a lo siguiente:

Bibliografía:

• Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos, articulo web consultado el día 8 de marzo de 2012 en: http://html.rincondelvago.com/fundamentos-y-tecnicas-de-analisis-hematologicos-y-citologicos.html

• Recuento de plaquetas, artículo consultado el día 23 de marzo en http://www.americalab.net/acerca-de-las-pruebas/recuento-de-plaquetas.html

• Martínez Fragoso, Vicente. Manual de Biometría Hemática. CBTis199, México, 2012. Pp. 30-32

PRACTICA NO. 2 PROCESAR CULTIVOS BACTRIOLOGICOS

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

Esta práctica se llevó a cabo el día lunes y jueves 12 y 15 de marzo 2012, en las instalaciones del laboratorio para prácticas de análisis clínicos del CBTis 199, como parte del programa de 4º semestre para la preparación de la carrera de Laboratorista Clínico, en su subdivisión procesar cultivos bacteriológicos.

OBJETIVO

Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización  de materiales de vidrio y medios de cultivo de uso común en Microbiología, así como de observar el efecto y la importancia de las condiciones asépticas en el control de la contaminación microbiana.

FUNDAMENTO

Los microorganismos, como todos los otros seres vivos, son verdaderamente susceptibles a los cambios de las condiciones  ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas de tipo físico y químico.

La esterilización se define como la destrucción completa de todos los microorganismos presentes incluyendo las formas vegetativas y las esporas.

Para lograr la destrucción de las bacterias, existen diferentes medios como son: la acción de los agentes químicos y los antibióticos.
Los principales métodos de esterilización empleados en un laboratorio de bacteriología son:
Calor húmedo, seco y filtración para los líquidos, sin olvidar que cuando se requiere una esterilización más completa se efectúa está usando gas (óxido de etileno) y el área de trabajo se expone a los rayos ultravioleta.
Entre los principales métodos físicos se encuentra la acción del calor, el cual puede ser seco o húmedo, considerando que el punto térmico mortal se define como la temperatura necesaria  para producir la muerte de la bacteria en un tiempo determinado.  
El calor húmedo se aplica para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan, siendo el más recomendable el autoclave.

MATERIAL

Mechero de Bunsen y Fisher

Tripie

Tela de asbesto

Portaobjetos

Cuba de tinción

Matraz Erlenmeyer de 250 ml

Algodón

Gasa

Papel estraza

Cinta testigo

Cajas Petri

Olla exprés

Asa de siembraSUSTANCIAS:

Muestra biológica: heces fecales y orina
Agar EMB
Agar Salmonella-Shigella
Fenol
Agua destilada
Colorantes de Gram
Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1.    Lavar perfectamente dos matraces con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente

2.    Dejar escurrir y secar sobre una toalla o papel de envoltura.

3.    Pesar con ayuda de una balanza la cantidad necesaria de medio de cultivo de agar EMB y S.S. para 40 ml de agua.

4.    Elaborar con algodón y gasa unos tapones para los matraces, que ajuste con holgura, sobre los que finalmente se colocara un capuchón de papel estraza.
5.    Vaciar 40 ml de agua destilada en el matraz ya seco.

6.    Limpiar el área de trabajo y rociarla con fenol para desinfectarla. Encender el mechero de Bunsen, y colocar sobre este el tripie y encima la tela de asbesto.
7.    Verter el polvo del medio S.S. al matraz, colocar este último sobre la tela de asbesto y disolver calentado. Dejarlo hervir NO MAS DE UN MINUTO

8.    Cuando se alcance el punto de ebullición, bajar el matraz del fuego, flamear el tapón y la boca del matraz, para taparlo y colocarle su capuchón de papel.  Repetir los pasos 5-8 para el medio EMB.

9.    Colocar las cajas de Petri cerca del mechero, y verter en una de ellas el medio S.S. hasta la mitad. Esperar a que solidifique.

 10. Esterilizar con autoclave solamente al medio EMB, de la siguiente manera:

a)    En la olla exprés verter agua hasta el nivel indicado (1/3 parte)
b)    Colocar la base dentro de esta y ponerla al fuego (con los mecheros Fisher)

c)    Acomodar los medios y materiales en la base de la olla.

d)    Cerrar la olla y esperar a que la temperatura se eleve
e)    Dejar que se caliente hasta los 121°C o 15 lbs de presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel del fuego sacando y metiendo uno de los mecheros.
f)     Mantener así por 15 minutos.
g)    Apagar el fuego y dejar a que la presión descienda a 0.
h)   Abrir cuidadosamente la olla y sacar los medios ya esterilizados.

11. Acercar el medio al área de trabajo, que se mantiene aséptica.

12. Dejar enfriar al medio, hasta una temperatura en la que el matraz caliente pero no queme la piel, y verter suavemente en la caja o cajas Petri el medio de cultivo.

13. Una vez que se tienen solidificados los medios de cultivo, se procede a sembrar en ellos. Se toma el asa, se flamea y se toma un poco de la muestra de heces, para hacer el rayado de la placa en sectores, sembrando en ambos medios. Se flamea nuevamente el asa y se procede a la misma operación pero con la orina.

 14. Se dejan incubar en la estufa de incubación por un lapso de 24-48 horas

 Preparación de frotis:

1.    Transcurrido este tiempo, sacar los medios de cultivo y hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en forma cualitativa

2.    Lavar  y secar perfectamente los portaobjetos

3.    Limpiar la mesa o lugar de trabajo con fenol

4.    Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.
5.    Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos.
6.    Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extender suavemente en una área circular de 2 cm de diametro aproximadamente o colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire

 7.    Fijar los frotis

8.    Teñir por tinción de Gram

9.    Dejar secar al aire y observar la preparación al microscopio localizando con el objetivo 10x, pasar luego a 40x y observar a detalle con el objetivo 100x, colocando previamente una gota de aceite de inmersión.

RESULTADOS

Al preparar y esterilizar los medios de cultivo se obtuvo una solución homogénea libre de microorganismos, y al verterlas en las cajas y solidificar, el medio S.S. era color rosado y el medio EMB, lucía verde y a trasluz se veía rojizo.

MEDIO EMB

 En el de las heces, había colonias de borde liso, de color violeta con un brillo verde metálico y de relieve convexo, colonias propias de E. coli En el lado de orina, no hubo crecimiento, solo una contaminación por hongo.

MEDIO SALMONELLA-SHIGELLA

En el medio S.S., donde fueron sembradas las heces, hubo un abundante crecimiento, con un cambio de color de rosa al amarillo en el medio, con colonias irregulares, mucoides y sin color, probablemente Shigella spp.

OBSERVACIONES

Se distinguen con un poco de dificultad en este campo algunos bacilos gramnegativos, algo cortos, probablemente se trate de Shigella dysenteriae

Se distinguen perfectamente bacilos gramnegativos, algunos agrupados en palizadas del frotis de la colonia verde metálico, sin duda alguna se trata de  Escherichia coli

 CONCLUSIÓN

Al sacar los cultivos de la estufa nos dimos cuenta que una era las características macroscópicas eran de verde brilloso y el profesor nos explico que se trataba de esterichea coli porque por lo general todos nosotros tenemos esterichea coli al igual que el paciente.

Al sacar el material de la olla, el trozo de cinta testigo tiene una pequeñas bandas que al reaccionar con calor, se tornan  color negro o gris y es debido a que cuando se expone a un proceso de esterilización por vapor, los reactivos de la cinta cambian su color al reaccionar.
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.
El material alimenticio en el que crecen los microorganismos se llama medio de cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:
Temperatura
Grado de humedad 
Presión de oxígeno adecuado
Un grado correcto de acidez o alcalinidad
Contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
Debe estar exento de todo microorganismo contaminante

Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes, dependiendo de las necesidades y exigencias de las bacterias.

Fuentes consultadas:

·         Métodos de esterilización, consultado el día 17 de marzo del 2012, en http://www.monografias.com/trabajos10/meste/meste.shtml

·         Medios de cultivo en Microbiología, consultado el día 17 de marzo 2012 en http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm

PRACTICA NO. 1 PROCESAR CULTIVOS BACTEREOLOGICOS

PREPARACIÓN, FIJACIÓN Y COLORACIÓN SIMPLE DE FROTIS

OBJETIVO

Aprender las técnicas de preparación del frotis, de fijación y coloración más utilizadas en el estudio macroscópico de cultivos bacterianos, para poder así dar pauta a la identificación de las principales formas bacterianas y comprender la importancia de las tinciones y su adecuado uso.

FUNDAMENTO

Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo oscuro para poder realizar la descripción de estos.
El microscopio más común es el de campo claro, en el cual la observación de células vivas es limitada, debido a que estas son incoloras y permiten el paso de un gran cantidad de luz.
Debido a este factor, la observación de frotis teñido es más recomendable.
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados.
Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del medio que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan generalmente con calor.

MATERIAL

Mechero de Bunsen
Asa de siembra
Portaobjetos
Microscopio
Pizeta
Tubos de ensayo
Centrifuga

SUSTANCIAS:

Muestra biológica: heces fecales frescas y orina
Cultivos bacterianos
Azul de metileno
Alcohol etílico
Fenol
Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1. Analizar macroscópicamente al medio de cultivo
2. Llenar a la mitad un tubo de ensayo con agua destilada. Tomar un aplicador e introducirlo a la muestra de heces, tomando lo mas mínimo posible de estas y disolver en el tubo con agua.

3. Tomar un poco de orina, depositarla en otro tubo de ensayo y centrifugar durante 5 minutos a 3 000 rpm.

Preparación de frotis:

1. Lavar  y secar perfectamente los portaobjetos
2. Limpiar la mesa o lugar de trabajo con fenol
3. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.
4. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Despues acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapon y flamear rapidamente la boca del mismo, introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra (En esta practica no se trabajo con cultivos liquidos).
5. Para el caso de cultivos liquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extender suavemente en una área circular de 2 cm de diametro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire
6. Si el cultivo es en medio solido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 4, extenderla suavemente y dejar secar al aire

 

7. Del tubo de agua con un poco de heces disueltas, se flamea el asa, se deja enfriar y se mete al tubo para tomar un poco de la suspension, que posteriormente se extiende en el portaobjetos.

8. Si hay sedimento en la orina, se decanta y se extiende el sedimento en el portaobjetos, con ayuda del asa previamente flameada.

Fijación del frotis:

1. Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas del mechero)

2. Los frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijaran con calor. Para esto se pasará el frotis rápidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero

 3. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento.

Tinción simple:

1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto

 

2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la pizeta con agua.

 3. Dejar secar al aire

4. Observar la preparación al microscopio localizando con el objetivo 10x, pasar luego a 40x y observar a detalle con el objetivo 100x, colocando previamente una gota de aceite de inmersión.

 OBSERVACIONES

En el medio de cultivo agar sangre, se encontraban colonias puntiformes, blanquecinas, lisas, además de que eran hemolíticas del tipo B.

En el otro medio (amarillo) las colonias eran semejantes.

Todo el campo se encontraba repleto de bacterias de morfología parecida a los cocos pero un poco alargados, agrupados en sarcinas, por ser cultivo de exudado vaginal, se trataba de Gardnerella vaginalis

Muchos residuos de alimentos, bastoncillos cortos (E. coli) y además destaca lo que parecía ser un huevecillo, que por su morfología semejaba al de tenia

RESULTADOS

En el frotis de orina y heces se encontraron bacilos cortos, tratándose de Escherichia coli, una bacteria que por lo regular habita el tracto gastrointestinal del ser humano, por lo tanto es común encontrarla en heces.
Sin embargo en orina, no es tan común, pues la mayoría de las veces se encuentra E. coli en la orina a causa de infección bacteriana.

En el medio de cultivo, en el cual había sido sembrado exudado vaginal se tomó de la colonia que estaba en el agar sangre, y tomando en cuenta las características macroscópicas y microscópicas, se determinó que se trataba de la bacteria Gardnerella vaginalis.

Gardnerella vaginalis se trata de una bacteria que es capaz en la mujer producir un cuadro clínico irritativo con flujo vaginal (vaginitis), y en algunos casos en el hombre balanitis (inflamación en la cabeza del pene).

Es un bacilo inmóvil no encapsulado, puede presentar fimbrias y es corto con una longitud de 0.5. - 1.5 mm, lo que hace que parezca un cocobacilo pleomórfico, que usualmente se tiñe como Gramnegativo o Gram variable. Es un organismo anaerobio, presenta hemolisis del tipo beta en agar sangre humana. Son cataliza y oxidasa negativo.
Esta bacteria se va a poder aislar en agar, sangre incubado en anaerobiosis o en una atmósfera de 5% de CO2 a 35°c por 48 horas.
Se originan colonias translucida u opacas de 0.3 a 0.5 mm de diámetro, puntiforme, redondas, lisas, con hemolisis tipo beta.

CONCLUSIÓN

Para hacer un frotis debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado. Si el cultivo proviene de un medio líquido, se transfiere con ansa una gota del mismo y se extiende hasta formar una fina película que cubra el centro del portaobjetos. Si el cultivo proviene de un medio sólido, se procede a colocar una gota de agua en el centro del portaobjetos, se flamea el asa, se deja enfriar y luego se extiende la suspensión bacteriana hasta formar una fina película sobre el portaobjetos sin tocar y esperar a que se seque.
Esperar hasta que el líquido se evapore o bien acelerar el proceso acercando el portaobjeto al aire caliente de la llama del mechero.

La fijación se efectúa para que los microorganismos queden adheridos al vidrio y no se desprendan del portaobjetos con los lavados a los que hay que someterlos posteriormente. La fijación coagula las sustancias proteicas de las células, lo cual hace que los microorganismos queden pegados al portaobjetos. Con este procedimiento no mueren todas las bacterias.

BIOGRAFIAS:
Gardnerella vaginalis, consultado el día 5 de marzo del 2012, en http://html.rincondelvago.com/gardnerella-vaginalis.html

Preparación de frotis bacteriano, consultado el día 6 de marzo 2012 en http://www.joseacortes.com/practicas/frotisbact.htm

Manual práctico de Microbiología ambiental, consultado el 8 de marzo 2012 en http://es.scribd.com/doc/57234084/27/TINCION-SIMPLE

PRACTICA NO. 5

CONTEO DE LEUCOCITOS

OBJETIVO

Aprender a realizar y aplicar la metodología para un recuento de Leucocitos por milímetro cúbico de sangre e interpretar el resultado.

FUNDAMENTO

Para el conteo de leucocitos, se usan métodos sistemáticos que son más rápidos y precisos, y los métodos manuales.
Todo método manual de recuento celular incluye 3 fases:
-Dilución de la sangre
-Muestreo de la sangre diluida en un volumen
-Recuento de células en ese volumen
Para el recuento de leucos se cuentan los 4 cuadrados de las esquinas, que corresponden a los  campos 1, 3,7 y 9.
Para su dilución, se hace lo mismo que para los hematíes pero empleando la pipeta de blancos, de modo que la solución que obtenemos es de 1/20. Se utiliza como diluyente el líquido de Turk. El líquido de Turk es hipotónico de modo que se destruyen los hematíes y así no entorpecen en el recuento.
El líquido de Turk consta de ácido acético glaciar 2ml, violeta de genciana disolución de 1% 1ml y agua destilada en cantidad suficiente para 1000ml. Deberá filtrarse a menudo para evitar levaduras y hongos.
En un principio es un poco difícil distinguir los leucocitos de los restos de membranas de los hematíes hemolizados. Se debe tener en cuenta que los leucocitos son más refringentes (más brillantes) al moverlo con el microscopio que los restos de hematíes. Se debe observar la presencia de la membrana citoplasmática y de la membrana nuclear (a veces más) como líneas finas y brillantes. Esto se observa fácilmente moviendo el microscopio hacia delante y hacia atrás

MATERIAL

Pipeta de Thoma para glóbulos blancos (perla blanca)
Equipo para venopuncion (Tubo lila)
Boquilla blanca
Tubo de goma
Tubos de ensayo
Papel parafilm
Cámara de Neubauer
Cubrehematimetro
Microscopio
Gasas

SUSTANCIAS

Alcohol al 70% 
Sangre venosa
Liquido de Turk

PROCEDIMIENTO

1.-Una vez seleccionada, se desinfecta la zona con alcohol al 70%, y se practica punción venosa. La sangre es recogida en un tubo lila con EDTA

2.-Colocar el tubo de plástico y la boquilla para aspirar en la pipeta

3.-Llenar la pipeta de glóbulos blancos con sangre hasta la marca 0.5 para realizar una dilución de 1/20. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. Si la sangre se pasa de la marca, se puede absorber con gasa el excedente

4.-Introducir la pipeta en el tubo o frasquito que contiene el diluyente (liquido de Turk) y absorber hasta la marca 11, no deben quedar burbujas.

5.-Se tapan ambos extremos de la pipeta con papel parafilm y se coloca en un rotador automático o se hace rotar manualmente de 2-3 minutos

6.-Montar la laminilla de vidrio en la cámara para recuento. Debe estar limpia y seca.

7.-Destapar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequeña cerca de un extremo de la cámara para que por capilaridad se llene exactamente.

 8.-Dejar 3 minutos  que los leucocitos se sedimenten

9.-Colocar en la platina del microscopio y enfocar la cuadricula a 10x. y contar  en los 4 cuadrados angulares.

10.-En el recuento se incluyen las células que cubren o tocan por dentro o por fuera las líneas limitantes superior e izquierda en el cuadro pequeño de recuento y no se consideran los que estén en los límites inferior y derecho.

OBSERVACIONES

Enfocando uno de los cuadros laterales, se aprecian claramente los 16 cuadros pequeños donde se tienen que contar los leucocitos que hay en ellos. Se debe de tener cuidado de no confundir los restos de eritrocitos hemolizados con los leucocitos, que deben de aparecer como puntos purpuras o negros.

 RESULTADOS

Los recuentos de leucocitos, al igual que los eritrocitos,  se expresan como concentraciones, que en este caso serían número de células por unidad de volumen de sangre, que es 1mm3

Después de contar los glóbulos blancos de los 4 cuadrados angulares, se suman el total de ellos y con dicha cantidad de hace el siguiente cálculo:
N° de leucocitos x mm3 = altura x dilución x área 
N° de leucocitos x mm3 = 1/10 x 1/20 x 4 = 1/10 000
N° de leucocitos x mm3 = 4/200 = 1/50
N° de leucocitos x mm3 = N° de leucocitos contados x 50
En el análisis hecho,  los resultados de la cuenta de células quedaron así por casilla:
El número de leucocitos fue de 120, al realiozar la operacion nos dimos cuenta qe estaba dentro del rango normal.

VALORES DE REFERENCIA
(Millones de células/mm3)
Hombres y Mujeres:………………………………..5 000-10 000

 CONCLUSIÓN

Los leucocitos son las células sanguíneas que dentro del organismo participan desarrollando diferentes funciones como son: fagocitosis, defensa inmunológica específica o inespecífica.
Existen dos grandes tipos de estos glóbulos:
Polimorfonucleares:
Basófilos
Eosinófilos
Neutrófilos
Mononucleares:
Linfocitos (células T y células B)
Monocitos
El recuento leucocitario representa el número de leucocitos en un litro  de sangre completa. La cuantificación o recuento de leucocitos es muy importante para el diagnóstico de enfermedades.
Un bajo número de glóbulos blancos se denomina leucopenia y puede deberse a:
Insuficiencia de la médula ósea (por ejemplo: debido a infección, tumor o cicatrización anormal).
Enfermedades vasculares del colágeno (como el lupus eritematoso sistémico).
Enfermedad del hígado o el bazo.
Radioterapia o exposición a la radiación.
Un alto número de glóbulos blancos se denomina leucocitosis y puede deberse a:
Anemia.
Tumores de la médula ósea.
Enfermedades infecciosas.
Enfermedad inflamatoria (como artritis reumatoide o alergia).
Leucemia.
Estrés emocional o físico intensos.
Daño tisular (por ejemplo, quemaduras).
Es muy importante comentarle al médico acerca de cualquier medicamento que se esté tomando, incluyendo productos de venta libre. Ciertos fármacos pueden interferir con los resultados del examen, como Sulfonamidas, Alopurinol, Ácido acetilsalicílico (aspirina), cloroformo, corticosteroides, epinefrina, heparina, quinina o triamtereno
La cámara de Neubauer o hemocitómetro es una lámina portaobjeto gruesa, en cuyo centro se hayan dos superficies cuadriculadas iguales, separadas del resto de la lámina por surcos y dos barras transversales algo más elevadas.

Una laminilla cubreobjetos ópticamente plan, que al colocarse sobre las barras elevadas de la lámina forma una cámara entre el cubreobjetos y la superficie cuadriculada, teniendo una altura de 0.1mm

En la cámara de Neubauer las áreas de recuento de eritrocitos y leucocitos son diferentes, como se muestra en la imagen.
Bibliografía:
Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos, articulo web consultado el día 8 de marzo de 2012 en: http://html.rincondelvago.com/fundamentos-y-tecnicas-de-analisis-hematologicos-y-citologicos.html
Conteo de glóbulos blancos, artículo consultado el día 16 de marzo en http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003643.htm
Martínez Fragoso, Vicente. Manual de Biometría Hemática. CBTis199, México, 2012. Pp. 22-24