PRACTICA No. 8

CUENTA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

OBJETIVO

 Determinar e identificar el número total de leucocitos contenidos en un frotis teñido, para la determinación de posibles leucemias o para el complemento de una biometría hemática

 FUNDAMENTO

 El recuento diferencial de leucocitos es una parte rutinaria de la biométrica hemática que puede ser útil en la valoración de una infección o inflamación, en la determinación de los defectos de intoxicación posible por sustancias químicas o drogas, en el monitoreo de trastornos sanguíneos como la leucemia, y en los efectos secundarios de tratamientos como la quimioterapia

El conteo de glóbulos blancos puede indicar enfermedades infecciosas e inflamatorias, leucemia y trastornos de la medula ósea.

Hay varios tipos de glóbulos blancos (GB) que normalmente se encuentran en la sangre: Neutrófilos (leucocitos polimorfonucleares; células en banda (neutrófilos ligeramente inmaduros), linfocitos tipo T (células T), linfocitos tipo B (células B), monocitos, eosinófilos y basófilos. Los linfocitos T y B no se distinguen entre sí en una preparación normal de un portaobjeto.

Una extensión o frotis sanguíneo consiste en recubrir parcialmente un porta con una gota de sangre, de tal manera que las células de ésta se dispongan formando una sola capa de ellas. Esto puede hacerse manual o automáticamente. Lo último se realiza mediante un aparato (spinner) que cen­trifuga rápidamente el porta con la sangre depositada en su centro. Con este aparato se obtienen unos frotis que presentan una distribución celular muy homogénea.

 PARTES DE UNA EXTENSIÓN.

CABEZA.

Es la zona inicial de la extensión.

Es la región más gruesa.

En ella se encuentra una mayor proporción de linfocitos, y los hematíes forman aglomerados (pilas de monedas).

CUERPO.

Es la zona media del frotis.

Su espesor es el apropiado.

En ella existe una adecuada proporción entre los distintos tipos de leucocitos.

Contiene la "zona ideal" de observación, que corresponde a la porción que limita con la cola.

COLA.

Es la zona final de la extensión.

Suele tener un aspecto redondeado.

Es la región más fina.

En ella se encuentra una mayor proporción de leucocitos grandes (granulocitos y monocitos), y además. Los hematíes están deformados y presentan una tonalidad uniforme.

En su porción terminal suelen ser más abundantes las plaquetas, sobre todo si son grandes.

. BORDES.

Contienen una mayor proporción de leucocitos grandes.

Si están deshilachados, en ellos las células son difíciles de reconocer por estar deformadas o destruidas

CARACTERÍSTICAS DE UNA BUENA EXTENSIÓN.

La cabeza ha de estar cerca de uno de los extremos del porta.

La cola debe estar cercana al otro extremo del porta, pero sin llegar a él.

El borde de la cola tiene que estar finamente deshilachado. Ese fino deshilachamiento recibe el nombre de "barbas".

Toda la extensión ha de ser fina y homogénea.

Los bordes laterales de la extensión deben estar separados de los bordes del porta por 1 mm aproximadamente.

Una extensión normal ha de tener una longitud de las ¾ partes del portaobjetos.

El uso de teñidores automáticos exige la realización de extensiones más cortas que las consideradas normalmente como correctas (con una longitud de la mitad del portaobjetos).

DEFECTOS DE UNA EXTENSIÓN.

Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud y excesivo grosor. Esto se debe a un inadecuado tamaño de la gota de sangre o/y a un error en la velocidad o/y a un fallo en el ángulo de extensión de la misma.

Presencia de escalones o estrías. Esto está ocasionado por una falta de uniformidad en el deslizamiento de la gota.

Existencia de abundantes zonas redondeadas que carecen de sangre. Esto se produce por la presencia de restos de grasa o de suciedad en el porta.

Extremo final excesivamente dentado.

OBJETIVO

Determinar e identificar el número total de leucocitos contenidos enun frotis teñido, para la determinación de posibles leucemias o para elcomplemento de una biometría hemática

MATERIAL

Portaobjetos

Cuba de tinción

Microscopio

SUSTANCIAS

Muestra de sangre con EDTA

Colorantes

PROCEDIMIENTO

Se coloca una gota de sangre a dos cm del extremo de una porta objetos

Con otro portaobjetos donde se encuentra la gota de sangre formando un ángulo de 45°

Deslizamos suavemente el portaobjetos para hacer el frotis, dejamos secar

Se hace la tinción de Wright y se observa al microscopio para hacer el conteo

OBSERVACIONES

Neutrofilo de banda

CONCLUSION

De acuerdo a con lo que  realizamos en nuestra tinción y en base a los conocimientos previos que tenemos de la identificación de estructuras leucocitarias, podremos identificar con facilidad estos cuerpos, cuantificándolos y diferenciándolos para conocer el estado de salud del paciente y así contribuir al diagnóstico de posibles leucemias u otras enfermedades. En base a los resultados obtenidos y comparándolos con los valores de referencia podemos deducir que nuestro paciente se encuentra en condiciones normales

• Neutrófilos: 40 a 60%
• Linfocitos: 20 a 40%
• Monocitos: 2 a 8%
• Eosinófilos: 1 a 4%
• Basófilos: 0.5 a 1%
• En banda (neutrófilos jóvenes): 0 a 3%

Significado de los resultados anormales:

Un conteo bajo de GB (leucopenia) puede indicar: insuficiencia de la médula ósea (por ejemplo, debido a granuloma, tumor, fibrosis), presencia de sustancia citotóxica, enfermedades vasculares del colágeno (como lupus eritematoso) enfermedad del hígado o bazo radiación.

Un conteo alto de GB (leucocitosis) puede indicar: enfermedades infecciosas, enfermedad inflamatoria (como artritis reumatoide o alergia) leucemia, estrés emocional o físico severo daño tisular (por causas como quemaduras).

BIBLIOGRAFIA

http://html.rincondelvago.com/extension-o-frotis-sanguineo.html

http://www.blogmedicina.com/2007/12/26/recuento-diferencial-de-leucocitos-en-sangre/



PRACTICA NO. 7

DETERMINACIÓN DE LA HEMOGLOBINA

Objetivo:
Determinar cuántos gr de hemoglobina (Hb) hay en toda la sangre circulante, para tener un diagnostico clínico ya que se pueden variar diversas enfermedades debido a un valor anormal de Hemoglobina.

Fundamento:

La hemoglobina es una proteína conjugada que sirve para el transporte de oxígeno y dióxido de carbono. La masa total de eritrocitos de un adulto contiene unos 600gr. De hemoglobina capaces de transportar 800ml de oxígeno.

Una molécula de hemoglobina consta de 2 pares de cadenas polipepticas (unión de aminoácidos) (globina) y 4 grupos proteicos HEM que contienen cada uno un átomo de fe en estado ferroso. Cada punto HEM se localiza en una zona determinada de una de las cadenas de polipepticos. Localizando cerca la superficie de la molécula, el HEM se combina de forma reversible con una molécula de oxigeno y dióxido de carbono. Este grupo HEM es el responsable del del color rojo de la hemoglobina (hb).

La parte proteica o globina tiene 4 cadenas polipeptidicas que se denominan con las letras α, β, γ, δ. Existe una cadena mas la ε que esta presente durante los 3 primeros meses de vida se diferencian unas de las otras en el numero o posición (de los aminoácidos de los que están compuestas). Por lo tanto existen varios tipos de hb. en el ser humano se pueden encontrar las siguientes hemoglobinas normales:

Hemoglobina A: consat de 2 cadenas α y 2 cadenas β en un adulto normal corresponde a mas del 95% del total.

Hemoglobina A´: consat de 2 cadenas α y 2 cadenas δ en un adulto sano esta en porción menor de 3%.

Hemoglobina F (fetal): consa de 2 cadenas α y 2 cadenas γ. Es la hemoglobina principal en el feto desde el 4° mes del embarazo hasta aproximadamente los 6 meses de edad. La Hb F tiene mayor afinaidad por el oxigeno.

Hemoglobina Gower: consa de 2 cadenas α y 2 cadenas ε. Desaparece casi por completo en el tercer mes de embarazo y empieza a aparecer la Hb fetal.

Algunos datos se obtiene exmainando a simple vista una muestra de sangre. Un aspecto normal del suero o del plasma revela que el pigmento esta en los glóbulos rojos. Si se agita en una sangre total normal en el aire durante 15 min. Adquere un color rojo claro por convertir la Hb en oxihemoglobina.

La sangre tiene un color rojo cereza brillante cuando el pigmento es carboxi-hemoglobina en la intoxicación por CO. El color es chocolate en la metahemoglobulemia y la banda malvada en alsulfohemoglobulemia.

Las distintas Hb tienen espectros de absorción características a las que determina en un espectofotometro. La identificación de difrenetes formas de la Hbcon la determinación de sus espectros de absorción puede hacerse de una manera sencilla 

Material y Equipo:

Un colorímetro fotoeléctrico o un espectrofotómetro.
Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
Pipeta semiautomática
Tubos de ensayo.
Cubetas cuadradas.
Gradilla
Gasa

Reactivos:

EDTA
Reactivo Drabkin
Ferrocianuro de potasio
Cianuro de potasio
Bicarbonato de potasio
Solución estándar de cianometahemoglobina

Reactivos biológicos:
Sangre venosa con EDTA.

Técnica:

1.-En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin, marcarlo como problema (P).

2.-Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA).

3.- Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos 20 veces antes de tomar la muestra.

4.-Con una pipeta automática o pipeta de Shali se toma exactamente 0,02 mL (20 µL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta.

5.-La sangre tomada del tubo con EDTA se vierte en el tubo que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.

6.- Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión y con mucha precaución

7.-Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se  efectúe la reacción.

 

8.-Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente, se llena las cubetas hasta la marca que se encuentra y se procede la lectura.

9.-Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotómetro con agua destilada / Drabkin.

Antes de hacer la medición con el espectrofotómetro hacer el siguiente procedimiento

PARA HACER LA MEDICION DE TRANSMITANCIA HACER EL SIGUIENTE PROCEDIMIENTO:

Medición de Transmitancia:

1.- Encender el Espectrofotómetro 30 minutos antes, después  seleccione la longitud de onda deseada (540 nm para Hb) con las teclas numéricas y oprima <GO TO>.  Aparecerá en la pantalla el valor numérico.

 

2.-Presine < %T> para Transmitancia.

     Aparecerá en la pantalla “T”.

 

3.-Insertemla cubeta con el blanco en el portacubeta, cierre la puerta y oprima <SECOND FUNCTION> Y <100 %>. Aparecerá En la pantalla 100.0 T.

4.-Remueva el blanco e inserte la muestra problema contenida en la celda y cierre la puerta.

 

 Aparecerá en la pantalla el valor en Transmitancia.

5.-Si desea imprimir, oprima <PRINT> para avance de papel y/o una segunda vez para la impresión en el papel del espectrofotómetro o <SECND REMOTE>  para mandar a un dispositivo externo (a la computadora).

6.-Retire la cubeta del compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta y  guárdela).

 

8.-Si no va usar más el aparato, apáguelo y cúbralo, si desea continuar trabajando, elija el modo de trabajo siguiente y continúe.

Resultado:

Este fue el resultado que nos salió en el espectrofotómetro.

Cálculos:

.461/.472 x 15 = 14.65

Rango:

Normal ya que era la muestra de una mujer

Cálculos:

Hb total = concentración de Hb (gr/ml) x volumen sanguíneo (ml).

En espectofotometro se aplica la siguiente formula:

Muestra/ estandar x 15 = Hb

Valores de referencia:

Niños al nacer…………………………….. 13,6 - 19,6 g/dL

Niños de 1 año…………………………..... 11,3 - 13,0 g/dL

Niños de 10 -12 años……………………... 11,5 - 14,8 g/dL

Mujeres……………………………………... 11,5 - 16,5 g/dL

Hombres……………………………………. 14,0 - 18,0 g/dl.

Observaciones:

Al hacer la práctica notamos que para determinar este volumen que existe de Hb circulante en la sangre es fácil y sencillo de sacar ya que a la hora de meterlo al espectrofotómetro prácticamente nos dice todo solo hay que sacar el resultado haciendo la operación básica que ya nombramos anteriormente.

Los exámenes de laboratorio pueden realizarse por muchas razones, como investigación rutinaria de salud o sospecha de enfermedad o de toxicidad. También pueden ser utilizados para determinar si la efectividad de un medicamento mejora o empeora. Los exámenes pueden medir el éxito o fracaso de un tratamiento. Pueden ser solicitados por razones médicas o legales. Las siguientes son posibles razones por las que este examen puede realizarse:

Acidosis láctica

Anemia de células falciformes

Anemia por deficiencia de hierro

Embolia grasa

Conclusiones:

Existen varios factores para determinar cuándo y con qué frecuencia se pueden realizar los exámenes. Su duración puede depender de los resultados o terminación de otros exámenes, procedimientos o tratamientos. Los exámenes pueden ser realizados inmediatamente en una emergencia o pueden ser demorados conforme una condición es tratada o monitoreada. Se puede sugerir un examen o llegar a ser necesario cuando aparecen ciertos signos o síntomas.

Debido a cambios de las funciones naturales del organismo durante el día, los exámenes pueden ser realizados en una determinada hora. Si usted se ha preparado para este examen con cambios en la ingesta de comida o líquidos, los exámenes pueden ser realizados de acuerdo con estos cambios. Los intervalos para la realización de los exámenes pueden basarse en el aumento o disminución de los niveles de medicamentos, drogas u otras sustancias en el organismo.

Bibliografía:

Hematología: fundamentos y aplicaciones clínicas

Escrito por Bernadette F. Rodak Pag. 171.

Laboratorio de diagnóstico clínico

Escrito por Díaz Martín, Gustavo A.Pag. 395-396

https://ssl.adam.com/content.aspx?productId=52&pid=52&gid=250149&site=welldynerx.adam.com&login=well1815

http://es.scribd.com/doc/3596207/DETERMINACION-DE-Hb-EN-SANGRE



PRACTICA NO. 6

CUENTA DE PLAQUETAS CON CÁMARA DE NEUBAUER

 OBJETIVO

Realizar e interpretar la técnica para la cuenta de trombocitos o plaquetas en la cámara de Neubauer.

FUNDAMENTO

Los trombocitos o plaquetas constituyen una parte esencial del organismo hemostático del cuerpo. Son cuerpecillos hialinos incoloros que miden de 2-4 μ, de bordes irregulares, pero pueden tener forma esférica u ovalada, carecen de núcleo y son muy frágiles. Provienen de una célula gigante que mide de entre 50-100 μ de diámetro llamada megacariocito.

Una de las principales funciones de las plaquetas es participar en los mecanismos de la hemostasia (Hemos=sangre, stasis=detención) adhiriéndose entre ellas y a las paredes de los vasos sanguíneos lesionados, para formar así el trombo plaquetario o tapón hemostático.

El líquido diluyente puede ser una solución estéril de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo (85 milimolar) y cloruro de sodio (31 milimolar). Este líquido se provee listo para usar y su conservación es indefinida en refrigerador (2 - 10° C) o puede ser también oxalato de amonio al 1%. El fundamento del método consiste en la producción de hemólisis por la utilización de un líquido hipotónico, y el mantenimiento de las plaquetas intactas y sin agrumar por la presencia de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo.

MATERIAL

Pipeta de Thoma para glóbulos rojos (perla roja)
Equipo para venopuncion (Tubo lila)
Boquilla roja
Tubo de goma
Tubos de ensayo
Papel parafilm
Cámara de Neubauer
Cubrehematimetro
Microscopio
Gasas
Caja de Petri
Papel filtro

SUSTANCIAS

Alcohol al 70%
Sangre venosa
Diluyente de plaquetas

PROCEDIMIENTO

1. Obtener 10 ml de sangre venosa, en un tubo con anticoagulante EDTA

2. Agitar la sangre de manera suave en el tubo para mezclarla con el anticoagulante

3. Llevar la sangre hasta la marca 1.0 de la pipeta de Thoma. Limpiar la punta con una gasa

 

4. Aforar con liquido diluyente de plaquetas hasta la marca 101 de la pipeta (Dilución 1:100)

5. Tapar los extremos con papel parafilm y mezclar durante 1 minuto

6. Colocar la Cámara de Neubauer sobre una superficie horizontal y poner el cubrehematímetro sobre las mesetas

7. Descartar las primeras 4 gotas de la pipeta. Con la quinta gota cargar la cámara, depositándola entre la meseta y el cubrehematímetro y dejarla difundir por capilaridad, teniendo cuidado de que no se formen burbujas o se derrame el líquido hacia los surcos

 

8. Colocar la cámara de Neubauer ya cargada en el interior de una caja de Petri, con papel filtro humedecido en agua para evitar la evaporación, dejar en reposo de 10 a 15 minutos

 

9. Observar al microscopio contando en la cuadricula central (para glóbulos rojos) las plaquetas que aparecen mucho más pequeñas que los hematíes, redondas, alargadas u ovales, altamente refringentes

10. El cuadro central de la cuadricula mide 1.0 mm por lado y está dividido en 16 cuadritos más pequeños, de tal manera que el número total de estos últimos es de 400, mismos en los que se lleva a cabo el recuento de plaquetas.

OBSERVACIONES

Cámara de Neubauer, 10x

Enfocando la cuadricula central se aprecian los 25 cuadros centrales, con una gran cantidad de plaquetas en ellos. Se pueden distinguir solo algunos eritrocitos, mucho mayores que las plaquetas, que desprenden gran brillo

Cámara de Neubauer, 40x

Uno de los cuadros centrales, lleno de plaquetas, de forma redonda la mayoría u ovalada.

RESULTADOS

Los recuentos de plaquetas, al igual que los eritrocitos y leucocitos, se expresan como concentraciones, que en este caso serían número de células por unidad de volumen de sangre, que es 1mm3

Después de contar las plaquetas presentes en los 400 cuadritos centrales, el número obtenido se multiplica por el factor de dilución de la siguiente manera:

N° de plaquetas x mm3 = No. De plaquetas contadas X dilución X 10

Dilución: 1:100

Este factor corresponde, para obtener los resultados por mm3 ya que el volumen de la cámara es de 0.1 mm3

El número de plaquetas fue de 535, por lo que al realizar los cálculos quedaron así:

No. de plaquetas = 535 X 100 X 10= 535 000 plaquetas por mm3, lo que indica un índice elevado de plaquetas.

VALORES DE REFERENCIA

(Millones de células/mm3)

Hombres y Mujeres:………………………………..150 000 - 450 000

CONCLUSIÓN

El recuento de plaquetas es de suma importancia y es parte del recuento celular de la sangre como prueba de rutina.

El paciente con un trastorno hemorrágico, clínicamente significativo, acude al médico con algunos tipos de síntomas hemorrágicos, con lo que se puede indicar la parte defectuosa del mecanismo de coagulación, y dentro de estas causas pueden estar la cantidad inadecuada de plaquetas.
La hemorragia de vasos sanguíneos subcutáneos en piel intacta se puede ver como petequias o equimosis. Cuando se encuentran equimosis en gran cantidad y sin traumatismo aparente, el trastorno se conoce como Diátesis Hemorrágica y puede ser producida por anormalidades en los vasos sanguíneos, por la disminución en el número de plaquetas o por el mal funcionamiento.
La disminución de plaquetas se denomina Trombopenia o púrpura trombocitopénica y se debe a lo siguiente:

Bibliografía:

• Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos, articulo web consultado el día 8 de marzo de 2012 en: http://html.rincondelvago.com/fundamentos-y-tecnicas-de-analisis-hematologicos-y-citologicos.html

• Recuento de plaquetas, artículo consultado el día 23 de marzo en http://www.americalab.net/acerca-de-las-pruebas/recuento-de-plaquetas.html

• Martínez Fragoso, Vicente. Manual de Biometría Hemática. CBTis199, México, 2012. Pp. 30-32